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腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

[收录:2011-05-16] [作者:] [服务:论文代写代发] [字体: ]
内容摘要:            作者:华平, 陈炬, 张惠忠, 杨淞然, 杨艳旗, 熊利华, 张华
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             作者:华平, 陈炬, 张惠忠, 杨淞然, 杨艳旗, 熊利华, 张华

【摘要】     【目的】 ?#25945;?#33146;病毒介导血管内皮细胞生长因子(VEGF165) 基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs) 后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】 构建含VEGF 基因的腺病毒表达载体,利用贴壁法分离培养MSCs后,用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率,用免疫组化、Western-Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】 腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率,转染效率与病毒感染复制数(multiplicyties of infection,MOI)具有量效关系。MOI为150倍时,转染效率>95%,转染VEGF后,MSCs可有效表达VEGF,9 d 时达到表达高峰(1 125 pg/mL),13 d 后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】 腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs,MSCs是一种理想的基因载体细胞,其携带的VEGF基因可获得?#32454;?#30340;表达水平。

【关键词】   血管内皮生长因子; 骨髓间充质干细胞; 腺病毒; 转染

    Abstract:  【Objective】 To investigate  the  expression  of  adenovirus transfected vascular endothelial growth factor (VEGF) in rat mesenchymal stem cells in vitro and the effect of transfection on MSCs proliferation. 【Methods】 A adenoviral vector containing VEGF165 gene was constructed and MSCs were isolated and expanded using the preplating method. The infection efficiency of adenovirus vector to MSCs was tested by Ad.GFP infection procedure. Ad.VEGF expression in MSCs and its secretion in culture medium were measured by immunohistochemical staining, Western blot, and  ELISA,  respectively. 【Results】 MSCs could be effectively transfected by adenovirus containing VEGF gene in vitro, the transfection efficiency has the dose-effect relationship with multiplicyties of infection (multiplicyties of infection, MOI). When MOI was 150, the infection efficiency was more than 95%. The expression of VEGF was traced both in cell lysate and in culture medium. A maximum production of VEGF was observed at 3~9 days after infection (1 125 pg/mL at the ninth day), and VEGF was found even in day 13. 【Conclusion】 Gene transfer technology mediated by adenoviral vector can transfect VEGF gene into MSCs with high efficiency. MSCs transfected by VEGF gene could express VEGF.

    Key words:  vascular endothelial growth factor; mesenchymal stem cells; adenovirus; transfection

    血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ,VEGF)是一种特异的与血管生长有关的因子,能与存在于内皮细胞表面的特异性受体结合,促进内皮细胞增值,刺激新生血管的形成[1]。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有取材方便、体外扩增容易、?#23376;?#22522;因操作、适合自体移植的特点,被认为是缺血性心脏病的细胞 治疗 和基因治疗的重要供体细胞[2,3]。我们通过构建VEGF 腺病毒载体, 并转染MSCs,然后检查其在MSCs 中的表达产物和表达产物的活性,同时观察转染对MSCs 的生长、转化有无影响,为进一?#35762;?#29992;VEGF 进行的基因治疗和将其用于促进组织工程化心肌组织的形成和再血管化提供实验和理论依据。

     1   材料和方法

    1.1   材   料

    IMDM培养基购于美国Gibco公司;胎牛血清( FBS )为Hyclone公司产品;Ficoll-paque分离液购于Pharmacia公司;胰蛋白酶和EDTA为Gibco公司产品;二甲基亚砜(DMSO) 购于美国Sigma公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)购于美国Sigma公司;ELISA 试剂盒购于美国R(D公司;ABC免疫组化试剂盒购于博士德生物制品公司;鼠抗人 VEGF抗体购于博士德生物制品公司;脂质体和细胞转染试剂盒购自Gibco 公司;hVEGF165基因片断、大肠?#21496;鶧H5α、真核表达载体pcDNA3 由本实验室保存。4周龄雄性SD大鼠,体质量200~250 g,由中山大学动物实验中心提供。

    1.2   方   法

    1.2.1   pcDNA3/ hVEGF165腺病毒载体的构建及鉴定  将hVEGF165插入pcDNA3 的EcoRⅠ和Hind Ⅲ多克隆位点,并转化DH5α进行扩增,凝胶电泳证实hVEGF165已插入pcDNA3 多克隆位点, 测序证实hVEGF165无突变。

    1.2.2   MSCs的分离和培养   将SD大鼠颈椎脱臼处死后,无菌条件下取下肢长骨,显露骨髓腔,用含体积?#36136;?5%胎牛血清的IMDM培养液冲洗骨髓腔获取骨髓细胞,将冲洗液收集于离心管中,2 000 r/min离心15 min(上海医用?#27835;?#20202;器厂离心沉淀仪,型号LXJ-II,r = 4 cm),弃上清及脂肪层,取沉淀,用IMDM培养液混匀,轻轻地层加到比重为1.077 g/mL的淋巴细胞分离液上,2 000 r/min离心10 min,收集中间的单核细胞层,用IMDM培养液1 000 r/min离心洗涤10 min,然后收集细胞,用含体积?#36136;?5%胎牛血清的IMDM培养液混匀后接种于培养瓶中,置于37 ℃含体积?#36136;?%的CO2孵箱中培养,每3 d换液1次,原代细胞生长至90%融合时,用2.5 g/L胰酶和EDTA消化后按1 ∶ 3的比例传代。

    1.2.3   Ad.GFP转染MSCs的效率测定   ①大鼠MSCs传两代后,将细胞接种12孔培养板,培养至90%融合时,弃去培养上清。为获得最佳的病毒感染MSCs,调整病毒感染复制数(multiplicities of infection, MOI ),?#27542;?#20026;转染倍数,范围为50~400。按MOI 分别为0、50、100、150、200、400加入纯化的Ad.GFP液(5×108 pfu),体积以PBS定容为100 ?滋L,另每孔加入100 ?滋L IMDM培养液,转染2 h后换含血清的培养液体积?#36136;?%CO2,37 ℃条件下培养48 h后检测荧光。②荧光显微?#23548;?#27969;式细胞仪检测转染率:转染48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光强度,消化细胞,用IMDM培养?#21512;?#32454;胞1次,重悬于20 g/L多聚甲醛中,流式细胞仪检测转染细胞比例。

    1.2.4   免疫组化法检测Ad.VEGF转染MSCs后VEGF蛋白的表达情况   MSCs传两代后,胰酶消化,铺盘于事先放?#37238;?#30772;片的6孔板内,每孔细胞数量为5×105,?#25945;?#21518;细胞贴壁生长于盖破片上。?#27835;?组:①转染Ad. VEGF;②转染Ad.GFP,③空白对照组。转染MOI=150,方法同前(因为发现MOI=150时,转染率可达到95%以上)。细胞转染72 h后,中性缓冲福尔马?#36136;?#28201;固定30 min,灭活内源性过氧化物酶,1 ∶ 50/PBS正常血清封闭。按1 ∶ 100稀释Ⅰ抗(鼠抗人VEGF单克隆抗体)加在玻片上,于37 ℃反应1 h,以1 ∶ 100稀释Ⅱ抗(羊抗鼠IgG),37 ℃反应30 min,加SABC反应20 min,PBS洗2次。然后用DAB显色,苏木素复染,常规脱水,封片,观察。以PBS代替Ⅰ抗作阴性对照。

    1.2.5   Western blot鉴定VEGF的表达   收获Ad.VEGF转染细胞,用PBS漂洗细胞3次,加入细胞裂解液,使细胞浓?#20219;?07/mL,冰浴30 min,12 000 r/min离心10 min,取上清液,按10 μg/mL加入蛋白酶抑制剂,-20 ℃冻存备用。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。转膜、免疫印迹:PBST洗涤4次,将膜放入可密封的塑料袋,加5 mL封阻液旋转摇动60 min,倾去封阻液,加入鼠抗人VEGF抗体工作液,室温下旋转摇动60 min,取出膜,200 mL PBST洗4次,每次15 min,将膜放入新?#30446;?#23494;封的塑料袋中,加入稀释的羊抗鼠二抗,室温?#20013;?#25671;动60 min,200 mL PBST洗膜4次,每次15 min,碱性磷酸酶显色液中显色。

    1.2.6   ELISA法测定培养上清中VEGF的含量

    参照ELISA试剂盒?#24471;鰲?#22312;96孔板待检孔内加入50 ?滋L检测稀释液RDIW,每孔中加入200 ?滋L标准品或待检标本,室温下孵育2 h,吸出检测孔内液体,使用冲洗缓冲液清洗3次,每孔内加入200 ?滋L VEGF抗体,室温孵育2 h,吸出检测孔内液体,使用冲洗缓冲液清洗3次,每孔加入200 ?滋L底物溶液,室温下避光孵育20 min,每孔内加入50 ?滋L终止液,在检测波长为450 nm、校正波长570 nm酶联仪上读取吸光度值(A),根据标准品测定结果, 计算 被检测培养上清内VEGF含量。

    1.2.7   检测转染Ad.VEGF对MSCs细胞增殖的影响   将细胞接种于96孔培养板,每孔100 ?滋L IMDM培养液,24 h后将Ad.VEGF和Ad.GFP转染细胞,48 h后每孔加入MTT 10 ?滋L,弃培养液,每孔加入DMSO 150 ?滋L,振荡10 min,570 nm波长测定。

    1.3   统计学处理

    SPSS10.0统计软件数据进行?#27835;觶?所有数据用x?#28291;?#24418;式表示,统计学处理采用t检验, P<0.05表示差异有统计学意义。

    2   结   果

    2.1   pcDNA3/ hVEGF165的鉴定

    琼脂糖凝胶电泳结果显示hVEGF165片段大小约560 bp,pcDNA3,hVEGF165连接产生pcDNA3/ hVEGF165大小约6 kb,经过EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后产生2 个片段分别约5.4 kb 和560 bp,hVEGF165经测序证实无突变。

    2.2   Ad. GFP转染MSCs的效率测定

    用不同滴度的Ad.GFP转染MSCs后?#27835;鯣FP的表达。在Ad.GFP转染培养细胞48 h后,GFP的表达明显增强(图1)。荧光显微镜下可见2种亚?#33322;?#26500;:Ⅰ型细胞(?#27542;芌S细胞)较少,细胞形态较小呈梭性(RS-1)或圆球型(RS-2),折光性较强,生长较快;Ⅱ型细胞为宽大、扁平的成熟的MSCs,细胞形态宽大扁平,折光性较弱。

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